本報記者 張佳星

　　諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎已然揭曉，但生物學(xué)家們還有機會。

　　據(jù)統(tǒng)計，1990年以來，有16次諾貝爾化學(xué)獎頒給了生物學(xué)方面的成就。以2017和2018年為例，諾貝爾化學(xué)獎就分別頒給了發(fā)明冷凍電鏡和對活性蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化研究。

　　被稱為諾貝爾風(fēng)向標(biāo)的引文桂冠獎，今年其化學(xué)獎也有兩項與生命科學(xué)密切相關(guān)，當(dāng)看到Southern(直譯“南方”)的鼎鼎大名時，記者當(dāng)即決定“押寶”這個無處不在的DNA驗證技術(shù)。

　　Southern印跡法由埃德溫·薩瑟恩(Edwin Southern)在英國醫(yī)學(xué)研究理事會從事科學(xué)研究時發(fā)明，相關(guān)論文首次發(fā)表時他僅僅35歲，以他名字命名的DNA印跡技術(shù)，可用于確定特定DNA序列，并判斷其功能、是否變異、圖譜位置等，他后續(xù)還發(fā)明了DNA芯片等技術(shù)。引文桂冠獎稱他的發(fā)明是高通量核酸分析工作及基因圖譜、診斷和篩查的開端，也是當(dāng)今個性化醫(yī)療的基礎(chǔ)。

　　可檢測遺傳病中的單基因突變

　　2007年江蘇省高考生物學(xué)試卷中有一道關(guān)于Southern印跡法的試題，題目給出Southern印跡試驗后獲得的圖像，請學(xué)生判斷不同的條帶說明了什么生命科學(xué)意義——

　　單基因遺傳病可以通過核酸雜交技術(shù)(Southern印跡法)進(jìn)行早期診斷。鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種在地中海地區(qū)發(fā)病率較高的單基因遺傳病。已知紅細(xì)胞正常個體的基因型為BB，鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者的基因型為Bb。有一對夫婦被檢測出均為該致病基因的攜帶者，為了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都進(jìn)行產(chǎn)前診斷。題目給出產(chǎn)前核酸分子雜交診斷和結(jié)果示意圖。根據(jù)凝膠電泳帶譜分析可以確定胎兒是否患有鐮刀型細(xì)胞貧血癥。

　　其中提到的B和b體現(xiàn)在DNA上僅僅是一個堿基的區(qū)別，如何能夠?qū)⑵鋮^(qū)分開來呢？Southern印跡法做到了。

　　它的原理可以形象理解為“釣魚執(zhí)法”和“打出原形”兩步——

　　B和b由于一個堿基的不同在不同的酶切反應(yīng)中就會反應(yīng)不同，通過特定酶的“釣魚執(zhí)法”，兩種基因“你向左，我向右”，但在外表還看不出來，這時候“鎖住原形”(轉(zhuǎn)移到尼龍膜等能鎖住DNA的膜上)通過可顯影的放射性同位素等做標(biāo)記，讓探針DNA把鎖住的原形呈現(xiàn)出來，實現(xiàn)“可視化”。由此，通過Southern印跡法，些微的DNA突變可以被檢測出來。

　　題目中提及的鐮刀型細(xì)胞貧血癥的基因基礎(chǔ)，正是薩瑟恩1978年利用該方法發(fā)現(xiàn)的。與此同時，薩瑟恩決定使用分子生物學(xué)方法對人類基因組進(jìn)行作圖。為了這個計劃中大規(guī)模序列分析的需要，薩瑟恩進(jìn)行了多項技術(shù)革新，包括使用凝膠電泳對經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的片段精確分子量的確定、根據(jù)凝膠結(jié)果對DNA序列進(jìn)行自動讀取等。

　　衍生出對蛋白等生命分子的檢測方法

　　由于以薩瑟恩名字命名的Southern印跡法與“南方的”英文一樣，隨后誕生的其他印跡法分別以Northern、Western命名。

　　當(dāng)待分析的物質(zhì)由DNA轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA時，“南”變成了“北”。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所蔡仕英等在介紹《電泳的原理、應(yīng)用及進(jìn)展》中提道：在電流作用下，薩瑟恩成功地將DNA片段從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上進(jìn)行分子雜交分析，因此稱為Southern印跡法。后來，艾爾文(Alwine)用類似方法也成功地將RNA從電泳膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上作分子雜交分析，但他并沒有稱這一技術(shù)為Alwine印跡法，而是稱之為Northern印跡法，以便與Southern印跡法相對應(yīng)。

　　1981年布瑞特(Burette)又成功地將SDS-PAGE膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上進(jìn)行免疫學(xué)分析(如抗原抗體結(jié)合、蛋白質(zhì)與配基結(jié)合等)，繼Alwine之后，Burette稱這一技術(shù)為Western印跡法。蛋白印跡法是一項廣泛用于檢測細(xì)胞或組織提取物中蛋白表達(dá)水平的技術(shù)。這項技術(shù)借助抗體與目的蛋白的結(jié)合作用，測量生物樣品中的蛋白質(zhì)水平。

　　這樣一來，在印跡電泳這個家族中，僅缺一個Eastern印跡法。后來有人提議將IEF膠(即等電聚焦電泳)中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上的技術(shù)稱為Eastern印跡法，但這一建議并未被廣泛接受。Eastern印跡法是一種檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的技術(shù)，其檢測目標(biāo)是蛋白質(zhì)上特定的修飾基團或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在Eastern印跡法的實驗中，通常要先用2D電泳將蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)到膜上，再用特異的探針去檢測。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能過程中普遍存在的調(diào)控手段。

　　在印跡電泳技術(shù)中，薩瑟恩作為開創(chuàng)者、先行者發(fā)明的技術(shù)，衍生出人們對于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生命活動的基本分子物質(zhì)的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法，引領(lǐng)了“‘南’者為大、號令四方”的研究探索次序和格局。

　　不僅如此，人們還舉一反三，實現(xiàn)了菌落上的定位檢測。用類似的方法將生長在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落做成復(fù)制皿后再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紙上變性并與特定的放射標(biāo)記的探針雜交，可以篩選出帶有特定DNA片段的菌落，這種技術(shù)稱為菌落雜交，又稱原位雜交。

　　菌落雜交，是因為生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。這種方法對于從成千上萬的菌落或噬菌斑中鑒定出含有重組體分子的菌落或噬菌斑具有特殊的實用價值。

　　DNA芯片使基因測序效率提升千萬倍

　　諾貝爾獎的授予是為了表彰對人類做出最重大貢獻(xiàn)的人，迄今為止，Southern雜交技術(shù)依舊活躍在生命科學(xué)研究的最前沿，并逐步走出實驗室走進(jìn)臨床，用于疾病的診斷和檢測。

　　最新的研究論文顯示，科研人員利用Southern雜交技術(shù)對人類的線粒體DNA進(jìn)行定量。在單個細(xì)胞中線粒體DNA基因組是整體基因組的“滄海一粟”，這使得定量檢測十分困難。

　　量少卻至關(guān)重要，線粒體DNA的缺失或突變往往是致命的，例如，在某些核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的人類免疫缺陷病毒感染患者中，線粒體毒性和線粒體DNA缺失也已報道。因此，用進(jìn)一步發(fā)展的Southern印跡法來估計人類基因組DNA樣品中的線粒體DNA含量十分重要。迄今為止，Southern雜交技術(shù)仍舊是兼顧穩(wěn)、準(zhǔn)、快的不可替代的DNA檢測技術(shù)。“Southern雜交技術(shù)已成為檢測特定DNA片段的經(jīng)典方法之一。此法快速、準(zhǔn)確、靈敏，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、轉(zhuǎn)基因動植物鑒定、動物疾病診斷以及DNA指紋分析等方面的研究�！毙陆�大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授馬正海等在相關(guān)技術(shù)的改進(jìn)方面做了探索總結(jié)的工作，使得該技術(shù)的實現(xiàn)更加便利。

　　Southern印跡法的常青不衰還體現(xiàn)在薩瑟恩本人不間斷的科研生涯中。資料顯示，在發(fā)明了著名的Southern印跡雜交之后，他從英國醫(yī)學(xué)研究理事會(MRC)來到牛津大學(xué)，在特殊的玻璃表面通過有效的組合化學(xué)方法合成了特定寡核苷酸序列，該方法最終發(fā)展成為DNA芯片。1996年，薩瑟恩建立了牛津基因技術(shù)公司(OGT)，主要進(jìn)行高通量的核酸分析工作。

　　DNA芯片技術(shù)已經(jīng)稱為現(xiàn)代生命科學(xué)儀器設(shè)備繞不開的必備組件，使得檢測效率實現(xiàn)了千萬倍的提升，也使得基因測序、精準(zhǔn)醫(yī)療的成本大大降低，有望普惠大眾。